畜牧業(yè)每年將生產(chǎn)240億噸廢水，廢水的排放導(dǎo)致水資源的嚴(yán)重富營養(yǎng)化。此外，集中飼養(yǎng)動物的大型農(nóng)場需要大量使用激素和抗生素，對周圍的淡水生態(tài)系統(tǒng)等產(chǎn)生負(fù)面影響。比如，畜牧業(yè)廢水中的厭氧消化后的出水的主要特點包括1）氨氮濃度高（1000-2000 mg/L），2）抗生素種類繁多，且3）碳氮比（C/N<1）往往低于傳統(tǒng)活性污泥所需的營養(yǎng)比例（C/N >5）。因此，厭氧消化后的水不利于后續(xù)活性污泥法的反硝化過程的進(jìn)行，從而導(dǎo)致總氮濃度偏高。另一方面，目前研究藻類處理法存在的問題包括：1）無法適應(yīng)高氨氮以及多類型抗生素所帶來的毒性問題，2）藻類的收集也是目前比較關(guān)注的問題；3）其較長的生長周期和廢水處理時間勢必會大大增加大規(guī)模連續(xù)式反應(yīng)系統(tǒng)的水利停留時間，從而影響整個水廠的建造和運營成本。

近日，由中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所的Howard H. Chou課題組，成都信息工程大學(xué)的張輝課題組以及美國克萊姆森大學(xué)的陳寰課題組在Bioresource Technology期刊發(fā)表重要研究成果"Two-stage continuous cultivation of microalgae overexpressing cytochrome P450 improves nitrogen and antibiotics removal from livestock and poultry wastewater"。

研究發(fā)現(xiàn)，一種小球藻（Chlorella vulgaris）通過定向進(jìn)化可以適應(yīng)在含有高氨氮和低碳氮比的畜牧業(yè)厭氧消化廢水中生長。并且本次研究采用了一種設(shè)計-建造-測試-學(xué)習(xí)（DBTL）相結(jié)合的研究模式優(yōu)化了利用該菌株來處理廢水的連續(xù)工藝，以實現(xiàn)加速氨氮的去除和縮短水利停留時間（HRT）。與此同時，經(jīng)過改造的菌株還有效地去除了廢水中的多種抗生素。該研究通過生理、化學(xué)、代謝物、轉(zhuǎn)錄組和遺傳分析，闡明了小球藻在廢水中生存的耐受性、氨氮去除和抗生素降解的機(jī)制。最終研究表明，在小球藻中過表達(dá)新鑒定的P450酶可以改善氨氮、有機(jī)氮和抗生素的降解。

這項研究為開發(fā)基于微藻的工藝以改善畜牧業(yè)中的氮和水循環(huán)提供了寶貴的見解。同時，在合成生物學(xué)和環(huán)境工程層面，該研究也為后續(xù)優(yōu)化藻類污水處理技術(shù)提供了新的思路和發(fā)展方向。

文章上線截圖

清潔的水源和食物是人類健康和全球可持續(xù)發(fā)展相互關(guān)聯(lián)的重要資源。工業(yè)化養(yǎng)殖利用大量清潔水，同時產(chǎn)生大量廢水，對淡水供應(yīng)造成負(fù)擔(dān)。據(jù)估計，畜牧業(yè)每年為了生產(chǎn) 560 億頭牲畜供消費會產(chǎn)生 240 億噸廢水，預(yù)計到 2050 年消費量將超過 1000 億頭牲畜 （Sepúlveda-Mu?oz et al.,2023）。為了滿足這種日益增長的需求，人們建立了大規(guī)模的集中飼養(yǎng)農(nóng)場，需要大量使用激素和抗生素 （Vaishnav et al.,2023）。然而，廢水往往在未進(jìn)行有效營養(yǎng)管理的情況下排放，導(dǎo)致全球 64-97% 的富營養(yǎng)化 （Silva-Gálvez et al.,2024）。抗生素在廢水中的積累及向環(huán)境的釋放可能會對抗生素耐藥性產(chǎn)生潛在的不利影響，加劇與耐藥病原體相關(guān)的現(xiàn)有問題 （Wang et al.,2021）。因此，畜牧業(yè)廢水管理不當(dāng)會對周圍的淡水生態(tài)系統(tǒng)以及人類健康和安全產(chǎn)生負(fù)面影響。

傳統(tǒng)的畜牧業(yè)廢水處理過程采用兩步法。首先，利用厭氧消化來極大地降低化學(xué)需氧量 （COD）。然后，使用好氧活性污泥氧化去除剩余的營養(yǎng)物質(zhì)。厭氧消化步驟至關(guān)重要，因為高 COD 會抑制污泥的生長 （Wang et al.,2016）。厭氧消化還有一個額外的好處，那就是以沼氣的形式創(chuàng)造綠色能源。在中國，每年通過加工牲畜糞便生產(chǎn) 145 億立方米沼氣 （Ran et al.,2021）。然而，厭氧消化后殘留的總氮（TN）較高，尤其是氨氮可高達(dá) 1000-2000 mg/L，使得厭氧消化出水中的碳氮比（COD/TN）較低，污泥沒有足夠的碳源進(jìn)行生長，從而降低了第二步中活性污泥去除營養(yǎng)物質(zhì)的能力 （Zhang et al.,2022）。基于微藻的處理工藝，其好處在于微藻獨特的生理和代謝途徑使得其可以通過固定 CO₂合成有機(jī)碳源，從而生長在低 COD/TN的污水環(huán)境中。然而，微藻對于高氨氮和復(fù)合型抗生素廢水的適應(yīng)能力較差，同時目前基于微藻的處理工藝需要較長的水力停留時間 （HRT），約為 8-12 天 （de Mendon?a et al.,2018），這限制了它們在商業(yè)工藝中的廣泛應(yīng)用。為此，本研究旨在探索小球藻去除畜牧業(yè)厭氧廢水中的氮和抗生素的潛在機(jī)制。并通過設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)（DBTL）策略，將環(huán)境工程和合成生物學(xué)方法相結(jié)合，用以去除廢水中的氮和異類污染物以及縮短水力停留時間。

定向進(jìn)化小球藻對畜牧業(yè)廢水的處理

利用定向進(jìn)化技術(shù)，篩選到了新型小球藻（M5）能夠快速地去除廢水中的總氮（TN）,氨氮（NH₄-N）和總磷（TP）。在鴨場厭氧廢水中實現(xiàn)了 192 mg TN/L/d、177 mg NH₄-N/L/d 和 2 mg TP/L/d 的去除率，在養(yǎng)豬場厭氧廢水中實現(xiàn)了 160 mg TN/L/d、125 mg NH₄-N/L/d 和 6 mg TP/L/d 的去除率 （圖1a 和b）。與之前發(fā)表的研究相比，在TN含量高出 4 倍的情況下，M5對TN去除率仍舊高出 8 倍 （Wang et al.,2016）。同時，發(fā)現(xiàn)M5可有效去除鴨場廢水中的強(qiáng)力霉素、磺胺甲氧噠嗪、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶（圖 1c）。在豬場廢水中，也可有效去除磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲嘧啶、強(qiáng)力霉素、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶、培氟沙星、金霉素和四環(huán)素（圖 1d）。

圖 1. 畜禽廢水的批量處理工藝。處理（a）鴨場和（b）豬場廢水時細(xì)胞密度、化學(xué)需氧量 （COD）、總氮（TN）、銨氮（NH₄-N）、總有機(jī)氮（TON）和總磷（TP）濃度的變化。M5 處理后（c）鴨場和（d）豬場廢水中抗生素的去除率

連續(xù)反饋式處理系統(tǒng)的搭建

為了能夠讓 M5 投入商業(yè)應(yīng)用，并且與傳統(tǒng)的活性污泥法的水力停留時間相匹配（HRT=4-6天），我們利用了 DBTL 策略來建立了一套新型兩級連續(xù)反饋式處理系統(tǒng)（CFP）。經(jīng)過了長達(dá)兩個月的觀察，CFP工藝在水力停留時間為4天的情況下實現(xiàn)了穩(wěn)定的污染物降解率，其中在鴨場廢水中的去除率為 334 mg TN/L/d、306 mg NH₄-N/L/d 和 4 mg TP/L/d，在豬場廢水中的去除率為 213 mg TN/L/d、213 mg NH₄-N/L/d 和 10 mg TP/L/d。即使在將系統(tǒng)總工作體積減少43% 后，使用CFP工藝的 NH4-N 去除率仍比搖瓶實驗高出 70%。另一方面，在對 CFP 系統(tǒng)中抗生素濃度的分析表明，林可霉素、恩諾沙星、磺胺甲氧噠嗪、螺旋霉素、磺胺嘧啶和泰樂菌素的去除效果均有所改善（圖 2f、g）。實驗數(shù)據(jù)證實了該套工藝已經(jīng)可以和傳統(tǒng)的活性污泥法的處理效率不相上下了，甚至在總氮的處理方面比污泥法更勝一籌。

圖 2. 連續(xù)反饋工藝處理畜牧業(yè)廢水。（a）連續(xù)反饋系統(tǒng)示意圖。處理（b、c）鴨場厭氧消化廢水（DFWD）和（d、e）養(yǎng)豬場厭氧消化廢水（PWD）后，I 和 II 階段的細(xì)胞密度、化學(xué)需氧量（COD）、總氮（TN）、銨氮（NH₄-N）和總磷（TP）濃度。從（f）DFWD 和（g）PWD 中抗生素去除率

新型P450酶用于畜牧業(yè)廢水處理

為了進(jìn)一步探索 M5 降解廢水的潛在機(jī)理，我們通過轉(zhuǎn)錄組測序挖掘了高表達(dá)的 P450 酶，其中經(jīng)過分析和比對，發(fā)現(xiàn)了一段完整的高表達(dá) P450 酶的基因（A23292）。為了驗證這段基因的潛在功能，將其重新在未進(jìn)化的原始小球藻（M2）細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行了過表達(dá)實驗。研究表明 A23292 過表達(dá)的小球藻細(xì)胞（M2+N）足以耐受畜牧業(yè)廢水中的抑制化合物。經(jīng)過M2過表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 處理后（M2+CO），鴨場和豬場廢水中的氨氮去除率分別提高了 11 倍和 5 倍（圖 3a、b）。因此，氨氮去除率的提高可能是由于 A23292 從廢水中去除了生長抑制化學(xué)物質(zhì)，從而促進(jìn)了更高的細(xì)胞生長，從而加速了氨氮的去除。在 A23292 過表達(dá)后，鴨場和豬場廢水中實現(xiàn)的 NH₄-N 去除率分別為 470 mg NH₄-N/L/d 和 240 mg NH₄-N/L/d。另一方面，M2 過表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 后，林可霉素、恩諾沙星和泰樂菌素的去除率分別提高了 60%、40% 和 130%（圖 3c）。這些增加表明A23292參與了這些抗生素的水解作用。

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圖 3. 細(xì)胞色素 P450 對畜牧業(yè)廢水的解毒測試。通過 M2 與空載體對照（M2+EV）、M5、過表達(dá)天然 A23292 的 M2（M2+N）和過表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A23292 的 M2（M2+CO），去除（a）鴨場和（b）豬場廢水中的化學(xué)需氧量（COD）、總氮（TN）、銨氮（NH₄-N）、總有機(jī)氮（TON）和總磷（TP）。（c）在 BG-11 中，通過過表達(dá)密碼子優(yōu)化的 A2329 的 M2 抗生素（500 μg/L）去除率

本研究主要提供了兩種改進(jìn)基于藻類的高氨氮畜牧業(yè)厭氧消化廢水的處理方法。一種方法是基于合成生物學(xué)改造，通過過表達(dá)密碼子優(yōu)化后的 P450 酶來增強(qiáng)對有毒物質(zhì)的解毒。另一種是基于 DBTL 策略，開發(fā)通過細(xì)胞回流步驟來增強(qiáng)細(xì)胞的毒性耐受性并保持細(xì)胞繁殖能力。這兩種方法已在實驗室規(guī)模上得到驗證，并且為以下學(xué)科領(lǐng)域和工程方面提供了一些新的思路和應(yīng)用：1）通過蛋白質(zhì)工程改進(jìn)小球藻 P450 酶的活性；2）分析結(jié)構(gòu)并探索 P450 酶在其他類型廢水中的潛在功能；3）可以研究基于藻類的 CFP 工藝與活性污泥工藝的結(jié)合進(jìn)一步去除 COD 和 TN。

中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的博士后肖睿為文章的第一作者，正高級工程師Howard H. Chou為文章的通訊作者。本研究得到了國家重點研發(fā)計劃、中國博士后科學(xué)基金以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。

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