近日，中國科學院深圳先進技術研究院陳業團隊于國際期刊Metabolic Engineering發表研究論文"Versatile xylose and arabinose genetic switches development for yeasts"。該研究利用來自曲霉菌種的轉錄激活因子XlnR和AraRA以及細菌轉錄阻遏因子XylR和AraRR，在酵母中開發了基于廉價誘導劑的高誘導強度，低泄漏的木糖和阿拉伯糖誘導系統。
釀酒酵母作為重要的真核模式生物和細胞工廠，已經有大量的天然或人工誘導系統被開發。但是，用于實際生產的大規模發酵的誘導系統依然局限于內源的半乳糖(GAL)系統。然而，半乳糖誘導系統存在若干不足，主要表現在對葡萄糖的抑制作用導致生長與生產過程難以分離，以及復雜的內源調控網絡在不同營養條件下導致誘導動力學行為的復雜性。此外，基因表達的誘導依賴于易降解且成本較高的半乳糖。D-木糖和L-阿拉伯糖作為農業廢棄物（如秸稈）水解產物的主要組分，具有成本低廉的優勢。鑒于釀酒酵母無法天然降解這些糖類，它們成為理想的專一性誘導劑，可用于生產大量化學品或蛋白質。
自2015年以來，科學家已經在酵母中開發了一些木糖基因表達誘導系統。過往的木糖誘導系統大多基于原核生物的阻遏轉錄因子XylRR構建，但是這些系統都有一個普便存在的問題：最大誘導轉錄水平偏低，且轉錄因子的濃度需要細調以避免引發宿主生長毒性。內在調控原理-阻遏轉錄因子的去阻遏以及原核生物與真核生物的轉錄激活機制的截然不同，決定了很難改造已有的木糖轉錄誘導系統。
文章上線截圖
絲狀真菌是生態環境中的分解者，具有強大的分解代謝能力，因此研究團隊著重在這類菌種中篩選能響應木糖及阿拉伯糖的轉錄激活因子。通過構建基于熒光報告基因的篩選系統，團隊最終找到了來自構巢曲霉和黑曲霉的轉錄激活因子-XlnR (AN7610)和AraRA (An04g08600)，能在釀酒酵母中分別劑量響應木糖及阿拉伯糖并啟動下游基因轉錄表達。
為克服天然啟動子的局限性，如序列冗長、轉錄調控信號多樣及結構復雜性，研究團隊采用結構緊湊的釀酒酵母ADH2強誘導型啟動子作為基礎，將XlnR的結合一致性序列xlno替換ADR1的結合序列，成功開發出響應木糖的半合成啟動子，顯著增強了木糖誘導下的基因轉錄表達。通過構建TSS與TATA-box、TATA-box與poly(A)區域間隔序列的文庫，并調整轉錄因子結合基序（motif）的數量，成功開發出具有廣泛動態范圍的全合成誘導啟動子。
基于轉錄激活因子的誘導系統通常泄漏水平較高，為應對泄漏水平較高的問題，研究團隊引入了原核生物的轉錄阻遏抑制信號，并設計了轉錄激活/抑制的雙調控系統。這一創新使得木糖雙調控系統的動態范圍擴展至4000倍以上，且最大誘導轉錄活性達到釀酒酵母強組成型啟動子TDH3活性的兩倍以上。同樣阿拉伯糖雙調控誘導系統動態范圍達300倍，最大誘導轉錄活性與TDH3啟動子活性相當。重要的是，農業廢棄物如玉米芯未經處理的水解物也可以充分激活該木糖誘導系統。最后，研究團隊綜合比較了本研究開發的木糖及阿拉伯糖誘導系統與釀酒酵母中常用的誘導系統（天然系統如GAL系統,Cu2+誘導啟動子PCUP1,甲硫氨酸抑制啟動子PMET3以及基于雌激素受體ER的合成誘導系統LexA-ER-VP16/B112），證實木糖雙調控系統就調控嚴謹性，誘導激活水平、動態范圍、誘導速度和對宿主的生長影響方面優于現有系統。
研究團隊驗證了這兩套誘導系統在高滴度（>100 mg/L）芳樟醇生產中的實用性，同時證實了使用玉米芯水解物作為唯一碳源和誘導劑來源，也能實現高滴度芳樟醇的生產。最后，團隊也證明了基于XlnR的木糖誘導系統可遷移到工業菌株如畢赤酵母、病原菌如光滑念珠菌和白色念珠菌（CUG支系酵母）。在畢赤酵母中，基于XlnR的木糖誘導系統的最大誘導水平高于其經典的甲醇誘導系統，并證實了其用于生產分泌蛋白的實用性。
本研究不僅為酵母提供了強大的遺傳開關，還提出了一種將激活/抑制信號整合到合成啟動子中的通用策略，以實現最優性能。
木糖及阿拉伯糖誘導系統開發策略，設計原理及應用
本文第一作者是中國科學院深圳先進技術研究院助理研究員郭淑慧，通訊作者是中國科學院深圳先進技術研究院研究員陳業。該工作獲得了國家重點研發計劃、國家自然科學基金，以及深圳合成生物學創新研究院的支持。
團隊相關亮點成果
通過與該研究相似的轉錄因子重構結合合成啟動子方法，以及對于轉錄因子表達量、DNA結合結構域及啟動子模塊的精準設計，可以在釀酒酵母及大腸桿菌中對于任意轉錄信號進行優化。基于該方法，陳業團隊與湖南大學的合作成果，以"On-Chip Engineered Living Materials as Field-Deployable Biosensing Laboratories for Multiplexed Detection"為題，已在Advanced Functional Materials期刊上發表，中國科學院大學碩士黎欣睿完成了細胞傳感器的開發。
原文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202416830
基于微流控芯片的現場可部署的ELM生物傳感實驗室（ELMlab-on-Chip）設計原理
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