近日，中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋環(huán)境與島礁生態(tài)全國重點(diǎn)實驗室、熱帶海洋生物資源與生態(tài)實驗室、廣東省海洋藥物重點(diǎn)實驗室閆巖研究員團(tuán)隊在真菌來源抗蟲活性生物堿的結(jié)構(gòu)多樣性與生物合成機(jī)制研究取得新進(jìn)展，相關(guān)成果以“Structural Diversification and Biosynthesis of Pesticidal Pyrroline-Derived Alkaloid from Penicillium. citrinum SCSIO DF147”為題，發(fā)表于國際知名期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry。該論文由碩士研究生王松濤（已畢業(yè)）、朱祥龍為共同第一作者，研究員閆巖、副研究員宋永相為共同通訊作者。大連理工大學(xué)的教授劉田團(tuán)隊在抗蟲方面，濟(jì)南大學(xué)老師王文貴在中間體合成方面做了重要貢獻(xiàn)。
隨著全球農(nóng)作物害蟲抗藥性的不斷增強(qiáng)，開發(fā)具有新穎作用機(jī)制、高效且低毒的生物農(nóng)藥已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的迫切需求。昆蟲幾丁質(zhì)酶（Chitinases）在昆蟲的生長、蛻皮及變態(tài)發(fā)育過程中扮演關(guān)鍵角色，抑制其活性會導(dǎo)致昆蟲生長停滯、化蛹失敗甚至死亡，因此被視為開發(fā)新型殺蟲劑的理想靶點(diǎn)。MOEP（1）類生物堿最早是從海洋來源的青霉真菌中發(fā)現(xiàn)的一類吡咯啉衍生化合物，憑借其優(yōu)良的抗蟲及抗菌性能，展現(xiàn)出作為先導(dǎo)藥物的應(yīng)用前景。然而，前期研究僅發(fā)現(xiàn)其具有抑制昆蟲保幼激素合成的作用，沒有更多的靶標(biāo)篩選，缺乏系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)多樣性和構(gòu)效關(guān)系研究。另外，關(guān)于MOEP化合物也僅有化學(xué)合成報道，其生物合成基因簇和生物合成研究也尚未知。限制了利用合成生物學(xué)手段對其進(jìn)行深入研究的途經(jīng)。
團(tuán)隊以幾丁質(zhì)酶抑制活性為導(dǎo)向，對一株沙蟲來源的海洋真菌Penicillium citrinum SCSIO DF147進(jìn)行深入挖掘，從中發(fā)現(xiàn)了5類包括吡咯、吡咯啉、吡咯烷、吡咯里西啶、及開環(huán)吡咯烷共15個吡咯啉衍生生物堿（1-15），含5個新化合物 (圖1)。為該類化合物的研究奠定了基礎(chǔ)。
圖1?從Penicillium citrinum SCSIO DF147及其突變體DF147/ΔpasB中分離得到的吡咯啉衍生物生物堿（1?15）（紅色數(shù)字表示新化合物）。
通過對幾丁質(zhì)酶（OfChtII 和 OfChi-h）抑制活性的構(gòu)效關(guān)系研究顯示，吡咯啉結(jié)構(gòu)單元和脂肪鏈的Δ8',9'不飽和雙鍵是該類化合物的關(guān)鍵功能基團(tuán)，吡咯啉結(jié)構(gòu)的變化和鏈上雙鍵位置的移動或變化都會造成活性的下降或消失（圖2）。在此基礎(chǔ)上，對鱗翅目害蟲小菜蛾的抗蟲實驗以及植物病原菌的抗菌實驗進(jìn)一步證明了構(gòu)效關(guān)系，顯示了化合物MOPE（1）良好的抗蟲抗真菌效果。尤其是對農(nóng)業(yè)主要害蟲小菜蛾（Plutella xylostella）在5 mM濃度下施藥5天后致死率達(dá)100%，化合物1的效果優(yōu)于陽性對照藥物除蟲脲(Diflubenzuron)（圖3）。
圖2?吡咯啉衍生生物堿構(gòu)效關(guān)系
圖3?用5.0 mM化合物1、8和13喂養(yǎng)的P. xylostella的死亡率。
NC：陰性對照，PC：用DFB處理的陽性對照。
進(jìn)一步，團(tuán)隊對活性化合MOEP的生物合成研究中，利用全基因組測序、基因敲除/回補(bǔ)、異源表達(dá)、以及關(guān)鍵酶的體內(nèi)外功能驗證等方法，確定了該化合物的生物合成基因簇，其分別由四個基因（pasA–D）編碼骨架合成酶PKS-NRPS（PasA）、細(xì)胞色素P450酶PasB，轉(zhuǎn)錄因子PasC和烯酰還原酶PasC組成。發(fā)現(xiàn)MOEP（1）化合物先由骨架基因負(fù)責(zé)的PKS-NRPS蛋白PasA和還原蛋白PasD協(xié)作，合成關(guān)鍵中間體羥甲基吡咯烷化合物8，化合物8進(jìn)一步經(jīng)細(xì)胞色素P450酶PasB脫去C2位的羥甲基以及C3位氫形成Δ2,3雙鍵，從而形成具有吡咯啉功能基團(tuán)的活性化合物1（圖4）。
圖4?吡咯啉衍生生物堿生物合成基因簇（A）和MOEP（1）的生物合成途徑（D）
該研究不僅拓展了MOEP類化合物的結(jié)構(gòu)類型，深化了其構(gòu)效關(guān)系研究、還在原有保幼激素靶標(biāo)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了其作用于幾丁質(zhì)酶的新靶標(biāo)，為該類化合物抗蟲機(jī)制的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為以幾丁質(zhì)酶導(dǎo)向的新型抗蟲抗菌先導(dǎo)化合物的發(fā)掘提供了借鑒。該研究也是在海洋微生物先導(dǎo)藥物的發(fā)掘中，繼從海洋放線菌SCSIO 11791中發(fā)現(xiàn)的具有幾丁質(zhì)酶抑制活性的抗蟲先導(dǎo)化合物lynamycin B（J. Agric. Food. Chem.?2021, 69(47),14086-14091.）之后的又一進(jìn)展。
以上研究工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、海南省自然科學(xué)基金、廣州市重點(diǎn)研發(fā)計劃、廣東特支計劃?“海洋藥物研究開發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊”和南沙科技計劃項目等的資助。
論文信息：Songtao Wang#, Xianglong Zhu#, Huijie Xie, Huijuan Li, Hanwei Li, Wengui Wang, Tian Liu, Yan Yan*, and Yongxiang Song*. Structural Diversification and Biosynthesis of Pesticidal Pyrroline-Derived Alkaloid from?Penicillium citrinum?SCSIO DF147. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2026, doi/10.1021/acs.jafc.5c15871
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