2023年11月9日，《Cell》期刊以封面文章的形式在線發(fā)表題為《Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells》（高比例胚胎干細胞貢獻的出生存活嵌合體猴）的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學研究所）劉真研究組、孫強研究團隊和中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院Miguel A. Esteban研究組合作完成。該研究在國際上首次成功構(gòu)建了高比例胚胎干細胞貢獻的出生存活嵌合體猴，并證實了猴胚胎干細胞可以高效的貢獻到胚外胎盤組織和生殖細胞。這對于理解靈長類胚胎干細胞全能性具有重要意義，為遺傳修飾模型猴的構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎。

　　胚胎干細胞是指由著床前囊胚的內(nèi)細胞團在體外分離培養(yǎng)而來的多能性細胞，在模式動物構(gòu)建、細胞治療、器官再生、類器官模型等生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。胚胎干細胞具有體外無限自我復制更新、誘導實現(xiàn)多向分化、胚胎注射形成嵌合體等關(guān)鍵特征，其中胚胎注射形成嵌合體被公認為是評估胚胎干細胞多向分化潛能的金標準。

　　小鼠胚胎干細胞注射到囊胚并形成嵌合體的技術(shù)是構(gòu)建遺傳修飾小鼠模型的關(guān)鍵技術(shù)。1984年首次實現(xiàn)小鼠胚胎干細胞胚胎注射形成嵌合體，2008年成功實現(xiàn)大鼠胚胎干細胞胚胎注射形成嵌合體。建立非人靈長類胚胎干細胞嵌合體技術(shù)對于生物醫(yī)藥研究具有非常重要的意義，然而非人靈長類胚胎干細胞嵌合體研究一直進展緩慢。

　　該研究的首要問題在于獲得具有高效發(fā)育潛能的胚胎干細胞。針對這一問題，研究團隊建立了處于6種不同培養(yǎng)體系下的食蟹猴胚胎干細胞，進而從克隆形態(tài)、免疫熒光、單細胞轉(zhuǎn)錄組、線粒體代謝、全基因組甲基化、核型分析和全基因組測序等多方面對處于不同培養(yǎng)條件下食蟹猴胚胎干細胞進行全面系統(tǒng)的評估。發(fā)現(xiàn)5iLAF、4CL和PXGL體系下培養(yǎng)的食蟹猴胚胎干細胞具有較高的多能性，而且4CL體系下的干細胞具有更好的傳代穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性。

　　胚胎干細胞注射入受體胚胎后的快速凋亡是影響胚胎干細胞成功嵌合的關(guān)鍵。研究團隊選用綠色熒光蛋白標記的4CL條件下的胚胎干細胞進行猴胚胎注射實驗，通過測試干細胞注射入胚胎后的不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間的組合，最終得到了既不影響胚胎正常發(fā)育又能保證干細胞存活的最優(yōu)嵌合胚胎培養(yǎng)條件。而且5iLAF和Primed體系下的胚胎干細胞在該優(yōu)化條件下也表現(xiàn)出胚胎注射后的高存活率。將注射了4CL和5iLAF干細胞的嵌合胚胎分別在體外延遲培養(yǎng)到第17天，發(fā)現(xiàn)注射的胚胎干細胞仍然可以高效存活，單細胞測序 表明猴胚胎干細胞可以與受體胚胎細胞同步發(fā)育，并且貢獻到第17天猴胚胎的不同細胞譜系中。

　　在系統(tǒng)性評估了不同培養(yǎng)條件下猴胚胎干細胞狀態(tài)和改進優(yōu)化了嵌合胚胎培養(yǎng)條件的基礎上，研究團隊進一步將注射了綠色熒光標記的4CL干細胞的胚胎移植到代孕母猴。在總共得到的10只出生或流產(chǎn)的仔猴中，有一只出生存活猴和一只流產(chǎn)猴檢測到胚胎干細胞的嵌合。研究團隊建立了包含PCR擴增、微衛(wèi)星親子鑒定、基因組單核苷酸多態(tài)性深度測序、流式細胞儀檢測、綠色熒光蛋白檢測、免疫熒光檢測的一系列嚴格的嵌合體分析流程，發(fā)現(xiàn)出生存活猴中胚胎干細胞的貢獻比例高達70%左右，流產(chǎn)猴中胚胎干細胞的貢獻比例約20%。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序也進一步表明了注射的胚胎干細胞可以跟受體胚胎細胞同步分化到出生個體猴的各種不同細胞譜系中。

　　胎盤組織和生殖細胞是胚胎發(fā)育和重編程過程中的兩類特殊組織或細胞。其中胎盤組織是由滋養(yǎng)外胚層發(fā)育而來，而生殖細胞發(fā)育過程中要經(jīng)歷更加劇烈的表觀重編程。研究團隊在兩只嵌合體猴的胎盤組織中均發(fā)現(xiàn)了胚胎干細胞的高比例貢獻?？紤]到小鼠胚胎干細胞幾乎不會貢獻到胎盤組織，該結(jié)果說明靈長類胚胎干細胞可能具有不同于嚙齒類的獨特的發(fā)育全能性特征。此外兩只嵌合體猴的生殖細胞中也發(fā)現(xiàn)了胚胎干細胞的高比例貢獻，這對后續(xù)基于該技術(shù)的遺傳修飾模型構(gòu)建至關(guān)重要。

　　該工作建立了系統(tǒng)評估不同培養(yǎng)條件下猴胚胎干細胞的多能性狀態(tài)的研究體系，并探索得到有利于胚胎干細胞存活的胚胎嵌合體的培養(yǎng)條件，顯著提升了胚胎干細胞注入胚胎后的存活效率，最終得到了出生存活的高比例胚胎干細胞貢獻的嵌合體猴，證實了注入的猴胚胎干細胞可以高效地貢獻到包括胎盤和生殖細胞在內(nèi)的各種不同組織和細胞。該研究對于理解靈長類胚胎干細胞全能性和發(fā)育潛能具有重要意義，為建立基于猴胚胎干細胞嵌合體的基因打靶和模型構(gòu)建技術(shù)奠定了基礎。

　　該研究嚴格遵守生物倫理規(guī)范，所有實驗均符合國際干細胞研究學會的研究指南。劉真研究員、Miguel A. Esteban研究員和孫強研究員為該論文共同通訊作者。博士研究生曹靜、副研究員李文娟、副研究員李杰、副研究員Md. Abdul Mazid、助理實驗師李春楊、博士研究生姜禹、博士研究生賈雯淇為該論文共同第一作者。該研究還得到了腦智卓越中心蒲慕明院士、西北農(nóng)林科技大學王小龍教授、華大生命科學研究院徐訊研究員和劉龍奇研究員、劍橋大學Patrick Maxwell教授以及華大生命科學研究院多位合作同事的大力支持。該研究獲得了科技部、中國科學院、基金委等資助。

圖1.不同培養(yǎng)條件下猴胚胎干細胞中SOX2，NANOG和KLF17的免疫熒光

圖2.不同細胞注射的嵌合胚胎體外延遲培養(yǎng)效果圖

圖3. 非人靈長類胚胎干細胞嵌合體研究模式圖

圖4. 胚胎干細胞嵌合體猴卡通寓意圖被選為該期Cell雜志的封面