近日，中國科學院南海海洋研究所張長生團隊在海洋微生物天然產物everninomicin的生物合成及工程菌株構建研究中取得新進展，相關成果以“Biosynthesis and Engineered Overproduction of Everninomicins with Promising Activity against Multidrug-Resistant Bacteria”為題，于2022年4月21日在線發表于ACS Synthetic Biology（《ACS合成生物學》）。

　　靶向細菌核糖體的正糖霉素類天然產物具有特殊的高度修飾的寡糖骨架，與目前商用的核糖體靶向抗生素如大環內酯類、四環素類和氨基糖苷類等抗生素靶點均不同，不易產生交叉耐藥，具有進一步開發的潛力。具有八糖骨架的everninomicin D是小單胞菌產生的正糖霉素類天然產物，自上世紀60年代起由美國先靈葆雅公司（Schering-Plough）分離鑒定，該公司通過調研發現其具有良好的抑菌活性。然而everninomicin的生物合成及代謝工程研究一直受限于野生型菌株的產量低下，其生物合成研究及構效關系分析一直進展緩慢。

　　研究團隊以生物活性為導向，發現南海來源的小單胞菌SCSIO 07395（田新朋研究員提供）具有產生微量everninomicin 類化合物的能力。由于該類化合物生物合成步驟較多，結構復雜且代謝關鍵節點未知，暫時難以開展理性的代謝工程研究，于是采取了直接增加整個生物合成基因簇的拷貝數的方法進行增產（圖1）。通過活性檢測及代謝物分析發現，與野生型菌株相比，工程菌株的everninomicin 類化合物1-4的產量顯著提升，同時還產生了野生型不產的新類似物5和6（圖1）。

　　將工程菌株發酵分離得到的everninomicin類似物與包括5種氨基糖苷類、3種大環內酯類、3種β-內酰胺類和3種四環素類在內的28種商用抗生素在體外對21株革蘭氏陽性菌及7種革蘭氏陰性菌進行了系統的活性比較。結果顯示everninomicin對葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌活性顯著，整體活性優于除thiostrepton和rifamycin外其他抗生素；此外，everninomicins對陰性菌中的鮑曼不動桿菌、霍亂弧菌和溶藻弧菌也具有中等強度的活性(圖1)。

　　然后進一步選擇了抑菌譜相似的vancomycin、linezolid及avilamycin同化學性質穩定的everninomicin D、E和M進行了半抑制濃度（IC50）的比較。測試結果顯示everninomicin D、E和M對葡萄球菌和腸球菌的IC50與vancomycin、linezolid及avilamycin相當；對于鏈球菌則顯示出明顯的優勢，特別是everninomicin D和M在體外對肺炎鏈球菌及豬鏈球菌顯示出納摩爾級水平的抑制作用；此外，everninomicin E對三種革蘭氏陰性病原體鮑曼菌、溶藻弧菌和霍亂弧菌活性較為顯著（表1）。最后，進一步利用基因簇倍增技術構建了everninomicin M的高產菌株，目前最高產量可達98.6 mg/L，為后續動物實驗提供了物質基礎。

　　綜上所述，本研究從南海來源的野生型小單胞菌出發，針對結構及合成途徑均非常復雜的天然產物，克服了野生型菌株遺傳操作上的困難，直接通過增加生物合成基因簇的拷貝數達成了初步的產量提升及化學多樣化，成功制備出多種具有顯著活性的everninomicin類似物，為快速提高微量且復雜的活性天然產物的產量供生物合成及構效關系研究提供了參考案例。

　　博士后朱夢奕和王利娟為本文共同第一作者，張長生研究員為本文通訊作者。本研究得到了國家重點研發計劃項目、國家自然科學基金委項目、博士后創新人才支持計劃、中國博士后科學基金、廣東省基礎與應用基礎研究基金、廣東省海洋經濟發展專項資金項目、王寬誠教育基金項目、海南省重大科技計劃項目、廣東省培養高層次人才特殊支持計劃和廣東省重點領域研發計劃項目等資助。

　　相關論文信息：Mengyi Zhu#, Lijuan Wang#, Haibo Zhang, Liping Zhang, Bin Tan, Qi Huang, Yiguang Zhu, and Changsheng Zhang*. Biosynthesis and Engineered Overproduction of Everninomicins with Promising Activity against Multidrug-Resistant Bacteria. ACS Synthetic Biology 2023, DOI: 10.1021/acssynbio.3c00055.

　　https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00055

圖1 利用基因簇倍增的方法獲得增加多種everninomicin類天然產物及其與商用抗生素的活性比較

表1 everninomicins與阿維拉霉素、萬古霉素及利奈唑胺對多種病原菌的半抑制濃度比較