近日，中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所張長(zhǎng)生團(tuán)隊(duì)在海洋微生物天然產(chǎn)物everninomicin的生物合成及工程菌株構(gòu)建研究中取得新進(jìn)展，相關(guān)成果以“Biosynthesis and Engineered Overproduction of Everninomicins with Promising Activity against Multidrug-Resistant Bacteria”為題，于2022年4月21日在線發(fā)表于ACS Synthetic Biology（《ACS合成生物學(xué)》）。

　　靶向細(xì)菌核糖體的正糖霉素類天然產(chǎn)物具有特殊的高度修飾的寡糖骨架，與目前商用的核糖體靶向抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氨基糖苷類等抗生素靶點(diǎn)均不同，不易產(chǎn)生交叉耐藥，具有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。具有八糖骨架的everninomicin D是小單胞菌產(chǎn)生的正糖霉素類天然產(chǎn)物，自上世紀(jì)60年代起由美國(guó)先靈葆雅公司（Schering-Plough）分離鑒定，該公司通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)其具有良好的抑菌活性。然而everninomicin的生物合成及代謝工程研究一直受限于野生型菌株的產(chǎn)量低下，其生物合成研究及構(gòu)效關(guān)系分析一直進(jìn)展緩慢。

　　研究團(tuán)隊(duì)以生物活性為導(dǎo)向，發(fā)現(xiàn)南海來源的小單胞菌SCSIO 07395（田新朋研究員提供）具有產(chǎn)生微量everninomicin 類化合物的能力。由于該類化合物生物合成步驟較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且代謝關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)未知，暫時(shí)難以開展理性的代謝工程研究，于是采取了直接增加整個(gè)生物合成基因簇的拷貝數(shù)的方法進(jìn)行增產(chǎn)（圖1）。通過活性檢測(cè)及代謝物分析發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，工程菌株的everninomicin 類化合物1-4的產(chǎn)量顯著提升，同時(shí)還產(chǎn)生了野生型不產(chǎn)的新類似物5和6（圖1）。

　　將工程菌株發(fā)酵分離得到的everninomicin類似物與包括5種氨基糖苷類、3種大環(huán)內(nèi)酯類、3種β-內(nèi)酰胺類和3種四環(huán)素類在內(nèi)的28種商用抗生素在體外對(duì)21株革蘭氏陽性菌及7種革蘭氏陰性菌進(jìn)行了系統(tǒng)的活性比較。結(jié)果顯示everninomicin對(duì)葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌活性顯著，整體活性優(yōu)于除thiostrepton和rifamycin外其他抗生素；此外，everninomicins對(duì)陰性菌中的鮑曼不動(dòng)桿菌、霍亂弧菌和溶藻弧菌也具有中等強(qiáng)度的活性(圖1)。

　　然后進(jìn)一步選擇了抑菌譜相似的vancomycin、linezolid及avilamycin同化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的everninomicin D、E和M進(jìn)行了半抑制濃度（IC50）的比較。測(cè)試結(jié)果顯示everninomicin D、E和M對(duì)葡萄球菌和腸球菌的IC50與vancomycin、linezolid及avilamycin相當(dāng)；對(duì)于鏈球菌則顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，特別是everninomicin D和M在體外對(duì)肺炎鏈球菌及豬鏈球菌顯示出納摩爾級(jí)水平的抑制作用；此外，everninomicin E對(duì)三種革蘭氏陰性病原體鮑曼菌、溶藻弧菌和霍亂弧菌活性較為顯著（表1）。最后，進(jìn)一步利用基因簇倍增技術(shù)構(gòu)建了everninomicin M的高產(chǎn)菌株，目前最高產(chǎn)量可達(dá)98.6 mg/L，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

　　綜上所述，本研究從南海來源的野生型小單胞菌出發(fā)，針對(duì)結(jié)構(gòu)及合成途徑均非常復(fù)雜的天然產(chǎn)物，克服了野生型菌株遺傳操作上的困難，直接通過增加生物合成基因簇的拷貝數(shù)達(dá)成了初步的產(chǎn)量提升及化學(xué)多樣化，成功制備出多種具有顯著活性的everninomicin類似物，為快速提高微量且復(fù)雜的活性天然產(chǎn)物的產(chǎn)量供生物合成及構(gòu)效關(guān)系研究提供了參考案例。

　　博士后朱夢(mèng)奕和王利娟為本文共同第一作者，張長(zhǎng)生研究員為本文通訊作者。本研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金委項(xiàng)目、博士后創(chuàng)新人才支持計(jì)劃、中國(guó)博士后科學(xué)基金、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金、廣東省海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目、王寬誠(chéng)教育基金項(xiàng)目、海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目、廣東省培養(yǎng)高層次人才特殊支持計(jì)劃和廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目等資助。

　　相關(guān)論文信息：Mengyi Zhu#, Lijuan Wang#, Haibo Zhang, Liping Zhang, Bin Tan, Qi Huang, Yiguang Zhu, and Changsheng Zhang*. Biosynthesis and Engineered Overproduction of Everninomicins with Promising Activity against Multidrug-Resistant Bacteria. ACS Synthetic Biology 2023, DOI: 10.1021/acssynbio.3c00055.

　　https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00055

圖1 利用基因簇倍增的方法獲得增加多種everninomicin類天然產(chǎn)物及其與商用抗生素的活性比較

表1 everninomicins與阿維拉霉素、萬古霉素及利奈唑胺對(duì)多種病原菌的半抑制濃度比較