深海微生物原位采樣新技術及應用
深海是一個由高壓和低溫組成的極端環境，并存在熱液、冷泉、泥火山、鹽鹵池等各種特殊生境。由于光線無法到達，深海生態系統被稱為為以化能自養微生物為生命基礎的“暗世界”。基于深海生物學研究在揭示生命起源與演化機制、解析全球碳氮元素循環過程以及尋找新的天然活性產物和工程酶類方面的重要意義和價值，越來越多科學研究人員將目光投向深海，并開展了一系列前沿性的深海探索項目。
作為海洋中最高豐度和生物量的生命形態，海洋微生物在碳、氮、硫等關鍵元素循環方面發揮重要作用，是生物地球化學循環過程中最重要的一員，因而成為海洋前沿科學研究的主要專注點之一。然而，受限于微生物培養技術條件的不足，實驗室可培養的微生物種類非常有限，由于受壓力、溫度、原位物質能量特征等因素的影響深海來源的微生物更是難以培養。因此，對微生物的研究極度需要非培養依賴性的技術手段。目前，利用DGGE電泳、16S rRNA文庫以及454焦磷酸法測序等手段，研究人員已對環境微生物的群落結構有了比較深入的認識。近年來高通量測序技術的快速發展更讓科學家們得以從宏基因組學和宏轉錄組學水平解析環境微生物的功能特征。宏基因組學是從DNA水平上對環境微生物所攜帶的功能特征基因進行分析。宏轉錄組學則是從RNA水平上反應微生物的原位基因表達情況，可以更真實的揭示環境微生物的活性狀態，日漸成為環境微生物學研究的發展趨勢。
相對于DNA分子，RNA非常易于降解，其半衰期一般僅有幾分鐘(Steglich et al., 2010)，這對如何獲取真實反映微生物原位表達活性的轉錄組數據構成極大挑戰。對于深海微生物取樣而言，常規手段是通過Niskin取樣瓶采集海水樣品，將樣品收回到船上后進行過濾收集和固定處理，這種取樣方式存在諸多不足，從深海取樣采集到回收至甲板上一般需耗時幾十分鐘至數小時不等，樣品回收過程中壓力、溫度，及溶氧量等諸多環境因素的變化，將影響微生物的活性狀態，致使獲取的深海微生物樣品無法真實反應其深海原位的基因表達情況。采用合適的裝備，對深海樣品進行原位富集過濾，并進行原位固定取樣成為解決這一問題的關鍵。
在深海原位微生物取樣技術方面，國外目前已經開展了相關的研發工作。其中，美國伍茲霍爾海洋研究所(WHOI)研發了擁有多個采樣瓶的序列生物水體采樣裝置，可根據科學需求選擇采集水體樣本或是微生物樣品，并能攜帶固定液完成樣品的原位固定，實現原位樣品序列采集功能。該實驗裝置已在大西洋中脊實驗航次中，搭載于ROV深潛器進行了驗證性實驗(Breier et al., 2009)。2014年，該裝置進行了系統升級，升級后的SUPR-V2系統功能更加全面(Breier et al., 2014)。Wurzbacher等人也設計開發了相對簡單的原位過濾固定取樣器(in situ filtration and fixation sampler, IFFS)，用于分析水體中放線菌actR基因的原位表達情況。該裝置配載脈沖觸發裝置，可在過濾給定體積的水樣后(設計水樣過慮體積為100ml-900ml) ，切換至固定液導管，實現對樣品的原位固定(Wurzbacher et al., 2012)。Sanders等人則設計了原位生物組織勻漿固定取樣器(in situ Mussel And Snail Homogenizer, ISMASH)，通過搭載ROV深潛器，借助ROV機械手抓取熱液區蝸牛后，可在海底放入該裝置，進行原位的生物組織勻漿及樣品保存，用于解析熱液區貝類和螺類共生菌的轉錄組與共生機制(Sanders et al., 2013)。此外， McLane實驗室作為一家專業科技公司（www.mclanelabs.com），服務于海洋科學研究，也根據客戶需要量身設計了一系列的海洋水體取樣裝置，并且部分裝置可搭載深海著陸器使用。不過，該公司的產品功能相對固化，對于特定需求(諸如高壓力耐受性)需對裝置做重新的設計調整。相對而言，國內對深海生物研究的起步較晚，技術積累相對缺乏。
因應深海科學研究的需求，中國科學院深海科學與技術研究所的科學及工程技術人員通力合作，設計了一套依托于著陸器的自動化深海微生物原位富集與固定取樣器(ISMIFF)。該取樣器是一套可在深海及深淵環境(深度大于6000的深海海域)下進行水體微生物原位富集過濾并將其生物信息即時固定的裝置。本裝置主要由控制艙和過濾艙兩個艙體組成。其中，控制艙是一個充油補償艙，包含控制電路板、泵、閥以及壓力傳感器等，過濾艙則主要用于放置生物濾膜。該裝置搭載于著陸器進行作業，由著陸器提供能源，并通過串口與著陸器進行通訊。
ISMIFF的作業流程圖1所示。作業開始前，需將裝置內的管路清洗并充滿無菌水。著陸器坐底后，為避開浮塵影響，延時0.5-2小時后向富集裝置發送運行指令，富集裝置控制泵開始運轉，將海水泵入含有0.22 μm生物濾膜(用于截留微生物)的過濾艙中。裝置內的壓力傳感器實時監控過濾管路中的液體壓力，根據壓力反饋控制泵的輸出功率，從而使管路中液體壓力保持在合理范圍。當富集裝置過濾海水體積達到預設置后，通過電磁閥切換試劑管路，將固定液注入過濾艙，以實現樣品原位固定。著陸器回收后，立即在實驗室進行濾膜樣品的處理與保存。
圖1. 深海微生物原位富集與固定取樣器及作業流程圖
ISMIFF可最大程度實現原位保真取樣。該取樣器在過濾水體總量方面也具有明顯優勢，濾水初始流速高達700 ml/min，實際測試中7小時內完成約300L海水的原位過濾，遠大于船載CTD采水器一次下作業的采水量240L，為在深海及深淵寡營養環境低豐度微生物樣品的獲取提供了便利。ISMIFF已完成121MPa(1萬米海水深度1.2倍的壓力值)的嚴格打壓測試，可實現全海深原位取樣，極大的擴展了裝置的應用范圍。
ISMIFF首先在中國科學院深海科學與工程研究所所執行的馬里亞納深淵科考航次中進行了實驗性應用。科學家們采集了挑戰者深淵序列深度的水體微生物原位樣品，通過宏基因組測序對深淵原位條件下的水體微生物群落組成進行了解析，結果表明原位條件下的微生物群落組成與常規Niskin采水瓶采集的樣品有很大差異(Wang et al. 2019)。基于新的基因組分揀技術，研究人員亦成功獲取了30個深淵微生物類群的高質量基因組序列，闡明了與氮硫相關的元素循環過程和轉錄活性特征，并重點闡釋了Chloroflexi和Marinimicrobia分別在深淵難降解型有機物和蛋白類有機物的代謝方面所發揮的重要作用(圖2；Gao et al. 2019)。該研究是中國科學家首次對深淵微生物基因組進行較為全面的解析并對其原位代謝活性進行了詳盡的報道，揭示出深淵特殊極端環境對微生物種群分化的驅動作用。另外，此研究還表明深淵特定微生物類群可能通過氧化CO來獲取能量，拓展了CO氧化菌的已知生存空間范圍(Gao et al. 2019)。
圖2. 深淵水體微生物生態角色全面解析
在國家重點研發計劃專項課題“冷泉系統生物演化及適應機制”的支持下，ISMIFF在海底冷泉微生物原位取樣方面也實現了突破。在2019年5月及2020年5月廣州海洋地質調查局“海洋地質六號”科考船的南海冷泉航次中，ISMIFF搭載“海馬”號ROV，于海馬冷泉區不同站位開展了底棲生物幼蟲及水體微生物的富集和原位固定取樣（圖3）。在2021年1月，由中國科學院深海科學與工程研究所“探索二號”船執行的海南科考航次中，科學家們借助“深海勇士”號載人潛水器將ISMIFF直接布放海底，成功進行了多位點的原位固定取樣（圖4）。應用ISMIFF進行海底采樣不僅能夠大幅增加過濾水體的體積，減少工作量，而且可以實現樣品原位固定，可以更好的服務于深海冷泉生態系統的科學研究。
圖3. ISMIFF原位取樣器借助“海馬”號ROV在進行海底原位取樣
圖4. ISMIFF原位取樣器直接布放于海底冷泉區進行原位取樣
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Breier JA, Rauch CG, McCartney K, Toner BM, Fakra SC, et al. (2009). A suspended-particle rosette multi-sampler for discrete biogeochemical sampling in low-particle-density waters. Deep-Sea Res PT I, 56: 1579-1589.
Breier JA, Sheik CS, Gomez-Ibanez D, Sayre-McCord RT, Sanger R (2014). A large volume particulate and water multi-sampler with in situ preservation for microbial and biogeochemical studies. Deep-Sea Res PT I, 94: 195-206.
Gao ZM, Huang JM, Cui GJ, Li WL, Li J, Wei ZF, et al (2019). In situ meta-omic insights into the community compositions and ecological roles of hadal microbes in the Mariana Trench. Environ Microbiol, 21: 4092-4108.
Wurzbacher C, Salka I, Grossart HP. (2012). Environmental actinorhodopsin expression revealed by a new in situ filtration and fixation sampler. Environ Microbiol Rep, 4: 491-497.
Wang Y, Gao ZM, Li J, He LS, Cui G, et al. (2019). Hadal water sampling by in situ microbial filtration and fixation (ISMIFF) apparatus. Deep-Sea Res PT I, 144: 132-137.
Sanders JG, Beinart RA, Stewart FJ, Delong EF, Girguis PR. (2013). Metatranscriptomics reveal differences in in situ energy and nitrogen metabolism among hydrothermal vent snail symbionts. ISME J, 7: 1556-1567.
