PNAS | DNA復(fù)制中的“前-后”協(xié)調(diào)
9月21日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所、深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院甘海云課題組在美國(guó)科學(xué)院院刊（PNAS）發(fā)表了題為“復(fù)制脅迫狀態(tài)下芽殖酵母中Rad53耦聯(lián)先導(dǎo)鏈和后隨鏈DNA合成的機(jī)制”（A mechanism for Rad53 to couple leading- and lagging-strand DNA synthesis under replication stress in budding yeast）的文章，甘海云研究員和哥倫比亞大學(xué)張志國(guó)教授為共同通訊作者。該項(xiàng)研究揭示了DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路成員協(xié)同響應(yīng)DNA復(fù)制脅迫的分子機(jī)制。作者通過(guò)分析DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路成員對(duì)脅迫狀態(tài)下復(fù)制叉狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)點(diǎn)通路成員Mec1，Mrc1（哺乳動(dòng)物中的同源蛋白為Claspin）突變后與Rad53突變體的表型高度一致，表明DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路是通過(guò)Rad53對(duì)復(fù)制體蛋白進(jìn)行調(diào)控。
論文首頁(yè)截圖
細(xì)胞分裂前的物質(zhì)準(zhǔn)備過(guò)程中，需要完成對(duì)遺傳物質(zhì)的復(fù)制。以有絲分裂為例，遺傳物質(zhì)DNA的復(fù)制主要發(fā)生在分裂前的S期。DNA能否及時(shí)準(zhǔn)確的復(fù)制，既關(guān)系到細(xì)胞能否完成分裂，也關(guān)系到遺傳信息能否被準(zhǔn)確的傳遞給子代細(xì)胞。然而，DNA復(fù)制過(guò)程中往往會(huì)遇到影響復(fù)制的因素，如DNA損傷，雙脫氧核糖核苷酸（dNTP）水平降低，轉(zhuǎn)錄與復(fù)制機(jī)器遭遇等。此類(lèi)現(xiàn)象被統(tǒng)稱(chēng)為DNA復(fù)制脅迫（replication stress）。
為了應(yīng)對(duì)復(fù)制脅迫，生物體進(jìn)化出了檢驗(yàn)點(diǎn)（checkpoint）機(jī)制（圖1）：DNA復(fù)制脅迫發(fā)生時(shí)會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA，感應(yīng)器蛋白感受到單鏈DNA的存在后，會(huì)激活激酶Mec1（哺乳動(dòng)物中的同源蛋白為ATR），Mec1被激活后通過(guò)磷酸化下游蛋白的形式將信號(hào)逐級(jí)轉(zhuǎn)導(dǎo)至效應(yīng)激酶Rad53（哺乳動(dòng)物中的同源蛋白為Chk1），激活后的Rad53會(huì)對(duì)DNA復(fù)制過(guò)程進(jìn)行多重調(diào)控以應(yīng)對(duì)復(fù)制脅迫。盡管Rad53作為響應(yīng)DNA復(fù)制脅迫的檢驗(yàn)點(diǎn)早已明確，但這一過(guò)程中Rad53如何協(xié)調(diào)復(fù)制機(jī)器中諸多蛋白的具體分子機(jī)制尚不清楚。
圖 1 DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)通路與DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路示意（2016, FEMS Yeast Research）
2014年以來(lái)，當(dāng)時(shí)作為哥倫比亞大學(xué)張志國(guó)教授團(tuán)隊(duì)成員的甘海云研究員（現(xiàn)為中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)院合成生物學(xué)研究所研究員）就開(kāi)始研究DNA復(fù)制機(jī)器響應(yīng)DNA復(fù)制脅迫的機(jī)制。并與合作者共同開(kāi)發(fā)了eSPAN技術(shù)（發(fā)表于2014年的Molecular Cell雜志），該技術(shù)使得特異檢測(cè)DNA復(fù)制過(guò)程中前導(dǎo)鏈和后隨鏈結(jié)合蛋白成為了可能。eSPAN（enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA）技術(shù)巧妙的將BrdU（脫氧核糖核苷類(lèi)似物，溴脫氧核苷尿嘧啶）標(biāo)記的新生DNA鏈富集技術(shù)與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)結(jié)合，并利用了新生前導(dǎo)鏈與新生后隨鏈方向不同的特征來(lái)分析蛋白在前導(dǎo)鏈和后隨鏈上的結(jié)合情況（圖2）。
圖 2 釀酒酵母中的eSPAN技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程
研究人員利用該技術(shù)對(duì)比分析了DNA正常復(fù)制與DNA復(fù)制脅迫狀態(tài)下前導(dǎo)鏈與后隨鏈結(jié)合蛋白的異同。結(jié)合對(duì)比分析的結(jié)果和相關(guān)遺傳學(xué)研究結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)降低胞內(nèi)dNTP水平使DNA復(fù)制處于脅迫狀態(tài)時(shí)，位于滯后鏈的上的PCNA會(huì)在檢驗(yàn)點(diǎn)激酶Mec1和Rad53的調(diào)控下，從滯后鏈上脫離以維持復(fù)制脅迫狀態(tài)下的基因組穩(wěn)定。隨后研究人員進(jìn)一步利用該技術(shù)對(duì)比分析了檢驗(yàn)點(diǎn)激酶Rad53缺失與否狀態(tài)下的復(fù)制叉及其結(jié)合蛋白的狀態(tài)。當(dāng)檢驗(yàn)點(diǎn)功能缺失且復(fù)制脅迫存在時(shí)，DNA復(fù)制解旋酶CMG復(fù)合體仍會(huì)前進(jìn)并解開(kāi)雙鏈DNA，但前導(dǎo)鏈復(fù)制較滯后鏈慢，從而導(dǎo)致前導(dǎo)鏈暴露出大段單鏈區(qū)域（后續(xù)表述統(tǒng)稱(chēng)為不對(duì)稱(chēng)復(fù)制）（圖3）。這表明檢驗(yàn)點(diǎn)激酶Rad53能夠協(xié)調(diào)DNA解旋酶復(fù)合體與前導(dǎo)鏈和后隨鏈復(fù)制速度，從而防止大段單鏈DNA暴露引起的復(fù)制叉坍縮及DNA損傷(相關(guān)研究發(fā)表于2017年的Molecular Cell雜志）。
圖 3 檢驗(yàn)點(diǎn)通路通過(guò)RAD53來(lái)防止復(fù)制脅迫時(shí)前導(dǎo)鏈暴露出大段單鏈DNA區(qū)域
上述兩項(xiàng)研究初步揭示了檢驗(yàn)點(diǎn)激酶Rad53在受到復(fù)制脅迫時(shí)對(duì)復(fù)制體蛋白的調(diào)控機(jī)制。然而，由于Rad53在復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路中處于下游位置，整個(gè)復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路是否參與該調(diào)控過(guò)程尚不清楚。
本項(xiàng)研究中，甘海云研究員團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路成員對(duì)脅迫狀態(tài)下復(fù)制叉狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)點(diǎn)通路成員Mec1，Mrc1（哺乳動(dòng)物中的同源蛋白為Claspin）突變后與Rad53突變體的表型高度一致（不對(duì)稱(chēng)復(fù)制），表明DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路是通過(guò)Rad53對(duì)復(fù)制體蛋白進(jìn)行調(diào)控。
此外，Mrc1不但具有檢驗(yàn)點(diǎn)功能，還直接參與DNA復(fù)制。有意思的是，Mrc1檢驗(yàn)點(diǎn)功能缺失時(shí)，細(xì)胞響應(yīng)復(fù)制脅迫的表型與Rad53突變體和Mec1突變體一致，而刪除Mrc1的復(fù)制功能時(shí)，不對(duì)稱(chēng)復(fù)制的表型消失。這暗示Mrc1的復(fù)制功能可能是檢驗(yàn)點(diǎn)Rad53的調(diào)控靶點(diǎn)。根據(jù)這一假設(shè)，進(jìn)一步的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在Rad53突變體中刪除Mrc1會(huì)使Rad53突變體的不對(duì)稱(chēng)分裂表型消失，這一結(jié)果初步證實(shí)了上述推測(cè)。
圖 4 響應(yīng)復(fù)制脅迫時(shí)，復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通過(guò)Mrc1來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)前導(dǎo)鏈與后隨鏈復(fù)制的調(diào)節(jié)
Mrc1是通過(guò)與Tof1-Csm3形成復(fù)合體來(lái)行使其DNA復(fù)制功能的。那么Tof1是否也參與這一過(guò)程呢？作者進(jìn)一步分析了Tof1突變體表型，證實(shí)了Tof1也處在這一調(diào)控通路中。至此，作者解析了檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白是如何在復(fù)制脅迫的情況下調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的分子機(jī)制：細(xì)胞感受到復(fù)制脅迫后，激活了復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)通路Mec1 à Mrc1 à Rad53，激活后的Rad53則通過(guò)調(diào)節(jié)Mrc1-Tof1來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)前導(dǎo)鏈和后隨鏈的復(fù)制協(xié)調(diào)以防止出現(xiàn)單鏈DNA造成基因組不穩(wěn)定（圖4）。
該工作中由甘海云研究員團(tuán)隊(duì)完成的研究得到了基金委國(guó)自然重大專(zhuān)項(xiàng)、廣東省合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的資助。
